Real-time Thermocycler (qPCR)

Mit den Real-Time PCR-Thermocyclern der qTOWER iris-Serie erhalten Sie die schnellsten und zuverlässigsten Real-Time PCR Ergebnisse für Ihre Anwendung.

Neben Geräten für Ihren Labortisch umfasst unser Real-time PCR-Portfolio auch vollautomatische Thermocycler zur Integration in robotisierte Workflows.

Quantitative PCR with real-time thermal cyclers

Die quantitative PCR (qPCR), auch als Real-Time PCR bezeichnet, ist ein grundlegendes Verfahren in der modernen Molekularbiologie. Die Methode dient der präzisen Quantifizierung von Nukleinsäuren wie DNA oder RNA und ist heute in Laboren der medizinischen Diagnostik, der biotechnologischen Forschung und der pharmazeutischen Industrie fest etabliert.

Einer der zentralen Vorteile der Real-Time PCR im Vergleich zur herkömmlichen Endpunkt-PCR ist die Echtzeitüberwachung: Bei der qPCR kann der DNA-Vervielfältigungsprozess in Echtzeit überwacht werden, wodurch die Ausgangskonzentration einer Probe beispielsweise präzise bestimmt werden kann. Dieser Vorteil macht die qPCR prädestiniert für Anwendungen wie die Bestimmung von Viruslasten in der Diagnostik oder die Feststellung von Krankheitserregern in der Lebensmitteltechnik.

Grundlagen der Real-Time PCR/qPCR

Die Real-Time PCR ist eine Weiterentwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der DNA- oder RNA-Sequenzen durch das gezielte, wiederholte Erhitzen und Abkühlen vervielfältigt werden. Vereinfacht ausgedrückt werden bei der PCR-Methode geringe Spuren von Nukleinsäure kopiert, exponentiell vervielfältigt und somit für die weiterführende Analyse nutzbar gemacht. Die klassische Endpunkt-PCR lässt allerdings keine Rückschlüsse auf die Menge an DNA oder RNA während der Durchführung zu – erst nach dem Ende des Verfahrens wird die Amplifikation durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht. 

Genau hier setzt die qPCR an: Durch die Verwendung fluoreszierender Marker, die an das während der Amplifikation entstehende DNA-Produkt binden, erhält der Anwender schon während des Verfahrens Einblicke in die Menge an Nukleinsäure. So nimmt die Fluoreszenz proportional zur Menge des amplifizierten Produkts zu, wodurch eine Mengenbestimmung möglich ist. Dadurch kann die qPCR nicht nur qualitative, sondern auch quantitative Informationen liefern – was zum Beispiel beim Nachweis von Viren oder Bakterien in der medizinischen Diagnostik einen hohen Mehrwert liefert.

Exkurs: Die Geschichte der qPCR

Die Entwicklung der quantitativen PCR geht auf die ursprüngliche Entdeckung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch Kary Mullis im Jahr 1983 zurück. Diese revolutionäre Technologie ermöglichte es, DNA auf eine Weise zu amplifizieren, die bis dahin nicht vorstellbar war. Die Weiterentwicklung zur qPCR erfolgte in den 1990er Jahren mit der Einführung von Fluoreszenztechniken zur Echtzeitüberwachung des Amplifikationsprozesses. Labore konnten nun nicht nur die Amplifikation von DNA nachweisen, sondern auch die genaue Menge der Ausgangs-DNA bestimmen. Diese Entwicklung führte zu einem Paradigmenwechsel in der molekularen Diagnostik und machte die qPCR zu einem unverzichtbaren Werkzeug in der modernen Forschung und Diagnostik.

Ablauf eines qPCR-Prozesses

Der qPCR-Prozess basiert auf dem Prinzip der klassischen Endpunkt-PCR und besteht im Wesentlichen aus drei Hauptschritten: Denaturierung, Annealing und Elongation.

1. Denaturierung: In diesem ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA durch Erhitzen auf etwa 94-98 °C in ihre Einzelstränge aufgetrennt. Dadurch wird der Zugang für die Primer ermöglicht, die im nächsten Schritt an die Einzelstränge binden.
2. Annealing: Bei einer Temperatur von 50-65 °C binden spezifische Primer an die komplementären Regionen auf den DNA-Einzelsträngen. Diese Primer dienen als Startpunkt für die Polymerase, die im folgenden Schritt die DNA synthetisiert.
3. Elongation: Die Temperatur wird auf etwa 72 °C erhöht, was die Aktivität der Taq-Polymerase fördert. Diese Enzym verlängert den DNA-Strang, indem es freie Nukleotide an den Primer bindet und einen neuen komplementären Strang erzeugt. Da die Taq-Polymerase in jedem Zyklus erneut wirkt, verdoppelt sich die DNA-Menge nach jedem Durchlauf.

In der qPCR wird dieser Prozess in einem sogenannten Real-Time Thermocycler durchgeführt, einem Gerät, das die Temperatur präzise in definierten Zyklen steuert und gleichzeitig die Fluoreszenzsignale erfasst, die bei der Amplifikation des Ziel-DNA-Produkts freigesetzt wird. Die Fluoreszenzintensität nimmt in direktem Verhältnis zur Menge der amplifizierten DNA zu, was die Bestimmung der Nukleinsäure-Konzentration in der Ausgangsprobe ermöglicht.
 

Aufbau eines qPCR Thermocyclers

Der Real-Time Thermocycler, auch qPCR Thermocycler genannt, ist das zentrale Gerät, das den Prozess der qPCR durchführt. Er steuert die Temperaturzyklen für die Denaturierung, das Annealing und die Elongation und ermöglicht gleichzeitig die Echtzeitdetektion der Amplifikationsprodukte. Ein typischer qPCR Thermocycler besteht aus folgenden Hauptkomponenten:

1. Thermoblock: Der Thermoblock enthält die Proben und ist für die präzise Temperaturregelung verantwortlich. Jede Probe weist – je nach Thermocycler-Modell – ein Volumen von 5 bis 100 µl auf und wird in einem kleinen Reaktionsgefäß platziert, das in den Thermoblock eingesetzt wird.
2. Optisches System: Das optische Detektionssystem erfasst während der Amplifikation die erzeugte Fluoreszenz. Diese Messungen erfolgen in Echtzeit und sind entscheidend für die quantitative Analyse der Nukleinsäure.
3. Software: Die Software des Thermocyclers ist für die Steuerung des gesamten Prozesses verantwortlich und wertet die Fluoreszenzdaten aus, um die Nukleinsäurekonzentration in der Probe zu berechnen. Die Auswertung erfolgt häufig über die Bestimmung des sogenannten Ct-Werts (Cycle threshold), der angibt, in welchem Zyklus das Fluoreszenzsignal den Hintergrundwert überschreitet.

Moderne qPCR Thermocycler bieten eine hohe Genauigkeit, eine schnelle Zykluszeit und die Möglichkeit, eine große Anzahl von Proben gleichzeitig zu analysieren.

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Anwendungen und Zielindustrien

Die qPCR hat sich aufgrund ihrer Präzision und Zuverlässigkeit in vielen Anwendungsbereichen etabliert. Die wichtigsten Einsatzgebiete umfassen:

1. Medizinische Diagnostik: In der klinischen Diagnostik wird die qPCR zur Identifizierung und Quantifizierung von Pathogenen wie Viren, Bakterien und Pilzen verwendet. Besonders in der COVID-19-Pandemie spielte die qPCR beim Nachweis des SARS-CoV-2-Virus eine zentrale Rolle.
2. Onkologie: In der Krebsforschung und -diagnostik wird die qPCR eingesetzt, um Mutationen in Krebsgenen zu detektieren oder die Expression von Tumormarkern zu quantifizieren.
3. Forensik: Die qPCR wird in der forensischen Wissenschaft zur Analyse von DNA-Proben verwendet, die an Tatorten gesammelt wurden. Sie dient dazu, Identitäten festzustellen oder Verbindungen zu kriminalistischen Untersuchungen herzustellen.
4. Lebensmittel- und Umweltanalysen: In der Lebensmittel- und Umweltindustrie wird die qPCR eingesetzt, um Krankheitserreger in Nahrungsmitteln oder Wasser nachzuweisen und die Qualität von Produkten sicherzustellen.
5. Forschung: In der Grundlagenforschung wird die qPCR zur Untersuchung von Genexpression, Gentransfer und genetischen Modifikationen eingesetzt. Sie ermöglicht präzise Untersuchungen der Aktivität bestimmter Gene in verschiedenen biologischen Systemen.

qPCR mit modernen Real-Time Thermocyclern von Analytik Jena

Mit der qTOWER iris und der qTOWER auto Serie bietet Analytik Jena leistungsstarke qPCR Thermocycler an, die sich neben einer hervorragenden Temperatur- und Auslesegenauigkeit auch durch ein besonders vielseitiges Anwendungsspektrum auszeichnen. Dank der weitreichenden Wahlfreiheit bei Verbrauchsmaterialien, Assays und Farbmodulen können Labore die qPCR flexibel und variabel einsetzen. Eine kompromisslose Mechanik und ein flüsterleiser Betrieb runden die Vorteile der qPCR Thermocycler von Analytik Jena ab.