Das Fundament für Ihr Next-Generation Sequencing (NGS)

Nukleinsäureextraktion als erster Schritt

Die Extraktion stellt den ersten Schritt dar, bei dem die DNA- oder RNA aus ihren biologischen Matrizen freigesetzt werden, um die nachfolgende Weiterverarbeitung zu erleichtern. Dieser entscheidende Schritt beeinflusst nicht nur den Ertrag und die Reinheit der extrahierten Nukleinsäuren, sondern hat auch einen erheblichen Einfluss auf die Fragmentgrößen, welche die NGS-Anwendung definieren und die Qualität der Bibliotheken bestimmen. Die Reinheit dieser Nukleinsäuren ist entscheidend für die Zuverlässigkeit der Sequenzierungsergebnisse, was die Bedeutung der Investition in optimale Laborausrüstung und Methoden unterstreicht.

Die Effizienz der Nukleinsäureextraktion bestimmt die Ausbeute an DNA oder RNA, der aus biologischen Proben gewonnen wird. Eine hohe Ausbeute gewährleistet eine ausreichende Menge an genetischem Material für nachfolgende Anwendungen, während die Reinheit den Grad an Verunreinigungen widerspiegelt, die die Sequenzierungsergebnisse verfälschen können. Effektive Extraktionsprotokolle werden angewendet, um Ausbeute und Reinheit zu maximieren und die Integrität des genetischen Materials für eine genaue Sequenzierung zu gewährleisten. Darüber hinaus zeigt die Wahl zwischen kurzen- und langen Fragmentgrößen für die Sequenzierung die Anpassung von Vorbereitungsprotokollen der Bibliotheken für spezifische Anwendungen auf. Während der Extraktion kann es zu unbeabsichtigter Fragmentierung von DNA oder RNA kommen, die die Verteilung der Fragmentgrößen in den Bibliotheken beeinflussen.

Auswirkungen der Sequenzierungsmethode auf die Bibliotheksvorbereitung

Die gewählte Sequenzierungstechnologie bestimmt den Vorbereitungsprozess der Bibliotheken entweder für die Sequenzierung von typischerweise 50 bis 300 bp kurzen Fragmenten oder für die Sequenzierung langer bzw. ganzer DNA-Moleküle mit bis zu Mbp Länge. Die Fragmentgröße spielt dabei eine entscheidende Rolle bei der Bibliotheksvorbereitung, da sie bestimmt welche Nukleinsäuren für welche Sequenzierung geeignet sind. Durch die Auswahl von Faktoren wie Fragmentierungsmethode und Inkubationszeit können Extraktionsprotokolle angepasst werden, um die gewünschte Fragmentgröße zu erreichen und so die Sequenzierungsergebnisse zu optimieren.

Darüber hinaus bedingt der Anwendungsbereich und der Typ der Nukleinsäure (DNA oder RNA) die notwendigen Schritte der Bibliotheksvorbereitung. Die zielgerichtete Sequenzierung konzentriert sich etwa auf spezifische Bereiche des Genoms, wodurch der Umfang der Datenanalyse begrenzt aber gleichzeitig Zeit und Kosten reduziert werden. Dies ermöglicht eine Sequenzierung mit einem viel höheren Abdeckungsgrad, da der Fokus auf kleineren und spezifischen Regionen des Genoms liegt. Daher erfordert die zielgerichtete Sequenzierung eine Amplifikation spezifischer Genfragmente oder Genpanels aus einem Genom. Im Gegensatz dazu bietet die Gesamtgenomsequenzierung (WGS) einen umfassenden Überblick über ein gesamtes Genom ohne potenzielle Verzerrungen durch PCR-Amplifikate und ist für ein breiteres Spektrum von Anwendungen geeignet.

Biometra Thermocycler sind perfekt an die Anforderungen für die NGS-Bibliotheksvorbereitung angepasst. Mit hoher Flexibilität durch verschiedene Modelle und Blockmodelle sind die Biometra Thermocycler für unterschiedliche Probendurchsätze und Prozessanforderungen geeignet. Sie sind mit fast allen handelsüblichen PCR-Verbrauchsmaterialien kompatibel. Besonders hervorzuheben ist, dass der Biometra TAdvanced der einzige PCR-Thermocycler auf dem Markt ist, der von 10x Genomics als kompatibel mit all ihren innovativen Methoden auf Einzelzellebene und in räumlicher Transkriptomik verifiziert wurde und empfohlen wird. Dies macht den Biometra TAdvanced zu einer zukunftssicheren Investition. Unter Berücksichtigung dieser wichtigen Aspekte gewährleistet der Biometra Thermocycler Reproduzierbarkeit, minimiert Verzerrungen und optimiert die Ausbeute, wodurch die Effizienz und Zuverlässigkeit der NGS-Bibliotheksvorbereitung verbessert werden.

Normalisierung und Pooling der Proben

Die Normalisierung ist ein entscheidender Schritt in der NGS-Bibliotheksvorbereitung, der sicherstellt, dass jede Bibliothek gleichmäßig vertreten ist und in ausreichender Tiefe sequenziert wird. Sie gleicht die Konzentrationen für das Multiplexing aus und vermeidet die Über- oder Unterrepräsentation von unterschiedlichen Proben. Eine Überrepräsentation kostet Kapazität auf der Durchflusszelle, während eine Unterrepräsentation zu einer schlechten Sequenziertiefe und einer ungenügenden Abdeckung führt, was möglicherweise wertvolle Proben verschwendet. Daher hilft die Normalisierung der Konzentrationen von NGS-Bibliotheken, konsistente und zuverlässige Ergebnisse auf kosteneffiziente Weise zu erzeugen.

Um Ressourcen zu sparen, können mehrere Bibliotheken gepoolt und im selben Lauf sequenziert werden. Das Kombinieren von Bibliotheken aus mehreren Proben in einem Lauf stellt die optimale Nutzung der Druchflusszelle sicher, was einen ökonomischeren Ablauf darstellt.